Выявлять канцерогены в водных экосистемах с помощью светящихся бактерий предложили в МФТИ

Исследование образцов донных отложений и тканей беспозвоночных, собранных в экспедиции.

Фото: Александр Лехнович / предоставлено пресс-службой МФТИ

Компактные биосенсоры (lux–биосенсоры) для выявления канцерогенов в водных экосистемах создали ученые лаборатории молекулярной генетики Московского физико-технического института. За основу технологии взяты генно-модифицированные бактерии, светящиеся в ответ на разные виды губительного воздействия токсикантов. Разработка успешно прошла испытание на пробах тканей животных, взятых из трех северных морей.

Острая проблема морей — загрязнение ядовитыми веществами в результате деятельности человека: работы предприятий, судоходства, ведения сельского хозяйства, добычи нефти. Среди этих химикатов особую угрозу человеку несут канцерогены. Они накапливаются в донных отложениях и живых организмах и в результате по пищевой цепи могут попадать в рыб, употребляемых людьми в пищу, например, в форель и семгу. Поэтому без достоверной оценки уровня опасности морских экосистем сегодня не обойтись.

Изобретение ученых МФТИ — выгодная альтернатива традиционным подходам к анализу загрязнения, предполагающим многоэтапную работу и использование сложного оборудования, но при этом не всегда позволяющим изучить реальное воздействие опасных веществ на живые организмы. В отличие от привычных методов, новая технология помогает не искать конкретные химикаты, а оценивать степень их накопления в морских организмах и комплексного влияния на клетки.

За основу биосенсоров исследователи взяли два вида бактерий — лабораторный штамм кишечной палочки Escherichia coli, часто используемый в биологических изысканиях, и сенную палочку Bacillus subtilis. Чтобы «научить» микроорганизмы светиться в результате воздействия канцерогенов, ученые модифицировали их ДНК. В результате получился очень чуткий и быстрый инструмент для оценки загрязнения экосистемы. В зависимости от яркости свечения можно сделать выводы о том, насколько сильно воздействуют на клетки содержащиеся в воде токсичные вещества. При этом исследователи вывели несколько штаммов микроорганизмов, каждый из которых сигнализирует об одном из нарушений, вызванном внутри него отравлением. Так, новые биосенсоры позволяют выявить общую токсичность среды для живых клеток, окислительный стресс, SOS–ответ, алкилирование ДНК и ряд других.

Подробнее об инновации корреспонденту «Научной России» рассказал главный научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной генетики МФТИ, доктор биологических наук Илья Владимирович Манухов.

«Мы брали гены, ответственные за люминесценцию морских бактерий, и ставили их под контроль специального промотора . Промотор — это последовательность ДНК, управляющая экспрессией генов: насколько часто и эффективно тот или иной ген проявляется в фенотипе. Для нашего исследования мы брали промоторы, ответственные за различные стрессовые факторы, — объяснил И.В. Манухов. — Например, бактерия может ощущать повреждение от воздействия какого-либо токсиканта в среде, вызывающего у клетки окислительный стресс (например, перекиси водорода). И для борьбы с окислительным стрессом у нее есть специальная система, реагирующая на появление перекиси в среде . Во время наших экспериментов мы чаще занимались SOS-ответом: за него отвечает ген recA, “чувствующий” повреждения в ДНК. Молекула ДНК — это двуцепочечная спираль, и, когда в ней возникают одноцепочечные разрывы, на это реагирует кодируемый геном recA специальный белок, который активирует в клетке бактерии системы репарации — восстановления целостности ДНК .

Мы использовали эту особенность бактерий: брали промоторы различных стрессовых направлений и ставили под их контроль гены люминесценции. Таким образом, клетки в ответ на появление тех или иных токсикантов начинали светиться. Соответственно, сегодня у нас есть штаммы микроорганизмов, отвечающие на окислительный стресс, повреждения ДНК, тепловой стресс, связанный с денатурацией белков, и тому подобное».

Технология успешно прошла испытание на пробах тканей беспозвоночных животных, собранных в донных отложениях трех северных морей — Баренцева, Карского и моря Лаптевых — на глубинах от 35 до 300 м. В число подопытных вошли морской таракан, морской паук и несколько видов амфипод (рачков, также называемых бокоплавами). Результаты исследования ученые представили в журнале Biochemistry (Moscow).

Как проходили эксперименты? Сначала исследователи отобрали донные отложения с помощью дночерпателя, затем из них путем промывки извлекались морские обитатели. Далее определялся вид донных организмов, после чего они измельчались с добавлением пастеризованной морской воды. Полученная «каша» с помощью пятиминутного центрифугирования разделялась на жидкую и твердую фракцию. Наконец, выделенную таким образом надосадочную жидкость добавляли в пробирки с генно-модифицированными бактериями. В зависимости от вида микроорганизмов емкости инкубировались при разных температурах: комнатной для кишечной палочки и 32 °C для сенной палочки. Яркость свечения бактерий оценивалась несколько раз с помощью люминометра.

В этом исследовании ученые МФТИ сфокусировались на биосенсорах, позволяющих выявить влияние токсикантов на ДНК бактерий.

«Помимо однонитевых разрывов, существуют и другие виды повреждений ДНК — например, модификация основания ДНК, называемая алкилированием. В этом случае к основанию молекулы прикрепляются метильная (CH₃-), этильная (C₂H₅-) или иная подобная группировка. Такие повреждения система SOS-ответа распознает не всегда. И ДНК-полимераза, отвечающая за синтез ДНК при делении клетки, дойдя до такого модифицированного основания, не “осознает”, что оно неправильное, и может ошибиться, поставив напротив него неверный нуклеотид. Таким образом возникает мутация. Это резко ускоряет мутагенез, что, в свою очередь, может приводить к мутациям в онкогенах и развитию раковой опухоли. Поэтому подобные вещества, не приводящие к мощным повреждениям ДНК и SOS-ответу, а вносящие небольшие химические модификации, которые заставляют “ошибаться” ДНК-полимеразу, наиболее опасны. Их даже называют супермутагенами», — сказал И.В. Манухов.

Анализ показал, что в некоторых образцах тканей животных в большом количестве содержались именно алкилирующие соединения. Самая высокая концентрация была обнаружена в обитателях Баренцева моря. В то же время исследование не выявило окислительного стресса или SOS–ответа бактерий.

Как заметил И.В. Манухов, результат оказался довольно неожиданным, поскольку в целом экологическую обстановку Северного Ледовитого океана можно считать благополучной. Ученый добавил, что особенно высокая концентрация супермутагенов обнаружилась в тканях морского паука, но пока сложно однозначно сказать, с чем это связано — с особенностью этого вида или всего лишь с тем, что это создание довольно долгоживущее и, соответственно, копит токсиканты дольше, чем те же рачки.

«Видимо, некие алкилирующие вещества накапливаются в осадочных породах, поскольку не могут перерабатываться бактериями из-за очень низкой температуры и недостатка кислорода на дне», — отметил И.В. Манухов.

Разработка успешно прошла испытание на пробах тканей беспозвоночных животных, собранных в донных отложениях трех северных морей — Баренцева, Карского и моря Лаптевых.

Фото: Александр Лехнович / предоставлено пресс-службой МФТИ

Исследователь привел несколько примеров алкилирующих соединений. Например, они могут возникать в организме человека во время переваривания колбасы в результате реакций с участием нитрита натрия — вещества, используемого для придания продукту насыщенного розового цвета.

Одно из алкилирующих соединений — нитрозодиметиламин — попадает в окружающую среду в результате неполного сжигания одного из компонентов ракетного топлива — несимметричного диметилгидразина. Поэтому сейчас так востребованы технологии ракет, не нуждающихся в этом веществе для полета, — например, новые российские носители серии «Ангара».

Впрочем, в случае с северными морями пуски ракет вряд ли могут быть источником алкилирующих веществ, хотя неподалеку от Северного Ледовитого океана располагается военный космодром Плесецк.

«Если бы источником алкилирующих веществ был несимметричный диметилгидразин, то нитрозодиметиламин выделялся бы прямо из почвы этих регионов при обработке перекисью водорода. Мы провели такой эксперимент и не обнаружили подобных результатов», — поделился И.В. Манухов.

Другой пример соединений, алкилирующих ДНК, — нитрозосоединения, образующиеся в результате разложения навоза. Ученые предполагают, что именно они накапливаются в донных отложениях северных морей.

Ранее ученые уже наблюдали подобную ситуацию на территории озера Байкал, куда несколько раз ездили в составе экспедиций с Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН. Поводом для анализа загрязнения стало массовое вымирание рачков-гаммарусов в дельте реки Селенги. 

«Оказалось, что по реке Селенге в Байкал стекают продукты разложения навоза. В Монголии есть серьезная проблема перевыпаса скота. Мясо из Монголии покупают и Россия, и Китай, это основа монгольской экономики. И в этой стране, конечно, есть экологические проблемы. Измерения показали, что процесс алкилирования идет. Проблема, вероятно, связана с тем, что бактерии в водных “артериях” природы не успевают переработать то количество навоза и мочи, которое попадает в реки, и в результате появляются нитрозосоединения. Полагаю, что по сибирским рекам это тем или иным образом попадает и в Арктику, где из-за холодной воды (так же, как и на Байкале) отходы не успевают перерабатываться и копится алкилирующий потенциал, способный приводить к распространению онкологических заболеваний», — сказал И.В. Манухов.

Создатели технологии отмечают, что оценка безопасности водоема по тканям его обитателей, «концентрирующих» в себе токсичные вещества и играющих важную роль в пищевой цепочке — перспективный способ узнать о загрязнении до того, как его уровень станет опасным для людей.

В планах ученых — детальнее изучить гипотезу о навозе как об источнике загрязнения северных морей.

«Мы показали в лабораторных условиях, что бокоплавов достаточно подержать одни сутки вместе с алкилирующими веществами (конкретно с метилметансульфонатом), чтобы они начали накапливать их в себе. Причем в наружной среде в результате супермутагена оказывается меньше, чем внутри этих донных организмов. Но мы пока не делали такого же эксперимента с нитрозопроизводными. Сейчас мы пробуем проводить исследования с соединениями лабораторного супермутагена нитрозогуанидина, но его проникновение внутрь гаммарусов затруднено. Впрочем, при разложении навоза чаще образуются другие вещества — нитрозодиметиламин, нитрозомочевина. Таким образом, надо ставить эксперименты с ними. Простыми словами, теперь нам нужно доказать, что гаммарусы действительно могут накапливать алкилирующий потенциал при инкубации в среде с азотистыми алкилирующими соединениями», — заключил И.В. Манухов. Ученый добавил, что они с коллегами также рассматривают возможность создания дополнительных биосенсоров, сигнализирующих о других видах стрессового состояния клетки.

Новость подготовлена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ

Фото на превью и на странице: Александр Лехнович / предоставлены пресс-службой МФТИ